Polimerāzes ķēdes reakcija ir molekulārās bioloģijas procedūra, kas dublē sadaļas no ģenētiskā materiāla (dezoksiribonukleīnskābe, DNS). No neliela daudzuma DNS tiek izgatavoti miljoniem identisku kopiju. Tādā veidā ir pieejami daudzumi, kas ir pietiekami dažādiem izmeklējumiem.
Kāda ir polimerāzes ķēdes reakcija?
Polimerāzes ķēdes reakcija ir molekulārās bioloģijas metode, kas dublē ģenētiskā materiāla sekcijas (dezoksiribonukleīnskābe, DNS). Termins polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) apraksta in vitro (latīņu: glāzē) reakciju ar fermenta polimerāzes (DNS polimerāzes) palīdzību, kas noved pie noteiktu gēns secības. Reakcijas produkts ir arī izejviela jaunam šīs reakcijas ciklam. To skaits molekulas dubulto un vienlaikus kalpo kā paraugs jaunam ciklam. To sauc par eksponenciālu reizināšanu. Tas notiek laboratorijā ar lielu dažu minūšu ātrumu, līdzīgi kā ķēdes reakcijā. Šis laboratorijas process atdarina ģenētiskās informācijas (DNS) dublēšanos, kas notiek dabiskos apstākļos replikācijas laikā. Amerikāņu ķīmiķis KB Mullis tiek uzskatīts par šī procesa atklājēju. 1983. gadā viņš ieviesa šo DNS sintēzes procesu un desmit gadus vēlāk viņam tika piešķirta Nobela prēmija ķīmijā.
Funkcija, ietekme un mērķi
Dzīvos organismos esošā DNS hromosomas ir garums, kuru nevar pastiprināt, izmantojot PCR. Tā vietā tas tiek izmantots, lai pastiprinātu noteiktu sadaļu. Tie var būt gēni, konkrēta a daļa gēnsvai reģioni, kuros netiek transkribēti proteīni, ti, ir nekodējoši. Šajās sadaļās parasti ietilpst ne vairāk kā trīs tūkstoši bāzes pāru, salīdzinot ar aptuveni divreiz trīs miljardiem bāzes pāru vienā komplektā hromosomas cilvēkiem. Polimerāzes ķēdes reakcijai ir nepieciešama viena vai divvirzienu DNS ķēde, kuras struktūrai jābūt vismaz daļēji zināmai. Papildus fermentam, polimerāzei, tiek izmantoti divi grunti. Tie ir DNS bloki, kas darbojas kā sākuma un beigu punkts. Viņus raksturo secība, kas precīzi atbilst pastiprināmam reģionam. Laboratorijā polimerāzes ķēdes reakcija tiek veikta programmējamā sildīšanas blokā. Nepieciešamie komponenti, piemēram, polimerāze, grunts, celtniecības bloki, lai izveidotu jauno virkni (dezoksiribonukleozīdu trifosfāti) un magnijs jonus pievieno kopā buferšķīdumā. Reakcijas temperatūras un laika programma sākas ar denaturēšanu temperatūrā virs 94 ° C. Šajā procesā divšķiedru DNS tiek sašķelta un atrodas vienpavedienu formā. Nākamajā posmā, aptuveni 70 ° C temperatūrā, grunts ir saistīts ar gēns secība un veido fermenta reakcijas sākumpunktu. No šejienes polimerāze sintezē komplementāro virkni. Pēc tam sākas jauns cikls, kas atkal sastāv no trim denaturēšanas, grunts saistīšanās un DNS virknes sintēzes posmiem. Polimerāzes ķēdes reakcija tiek izmantota tiesu medicīnā, klīniskajā diagnostikā un klīniskajos pētījumos. Kriminālistikā DNS tiek iegūta no āda, siekalas, mati, sperma vai asinis no nozieguma vietām un pēc pastiprināšanas salīdzina ar zināmiem paraugiem un izmanto noteiktu personu identificēšanai. Izmantojot šo ģenētisko pirkstu nospiedumu, paternitāti var precizēt arī ar modificētu pieeju. Slimību noskaidrošanā iesaistīto gēnu pārbaudei izmanto polimerāzes ķēdes reakciju. Dažas baktēriju slimības var klasificēt, atpazīstot noteiktas sekvences. Vīrusu slimības var raksturot, kad vīrusa DNS vai RNS tiek pārveidots un pastiprināts. In asinis skrīningu, ir iespējams noteikt hepatīts vai ar HIV starpniecību saistītas slimības ļoti agrīnā stadijā. Audzēja diagnostikā to izmanto audzēja šūnu identificēšanai. Tas dod iespēju klasificēt audzēju, novērtēt slimības gaitu, terapija un prognoze. Pētījumos polimerāzes ķēdes reakciju izmanto, lai identificētu ar dažādām slimībām saistītus gēnus. Gēnu klonēšanai, kas nav tas pats, kas organisma klonēšana, gēns tiek pastiprināts, pirms tiek pārnests uz citiem organismiem vektorā (latīņu: ceļotājs, nesējs ). Tie var darboties kā modeļi, lai labāk izpētītu slimības vai radītu proteīni ko var izmantot kā narkotikas.
Riski un apdraudējumi
Polimerāzes ķēdes reakcijai ir milzīgs potenciāls noteikt nelielu DNS daudzumu. Lai izmantotu daudzās iespējas un pasargātu no nozīmīgām kļūdām, jāņem vērā noteikti priekšnoteikumi un dažādi kļūdu avoti. Var pastiprināt tikai tās ģenētiskā materiāla daļas, kuru secība ir vismaz daļēji zināma. Ar šo metodi nevar pastiprināt pilnīgi nezināmas sekvences. Pēc tam pastiprināšanas produktus var vizualizēt. Ja gaidītais signāls nav redzams, kaut arī meklētā secība bija klāt, ir kļūdaini negatīvs rezultāts. Visbiežāk tas ir neoptimizētu vai slikti optimizētu reakcijas apstākļu rezultāts. Tie jānosaka kā mērķa secības funkcija. Šim nolūkam tiek pārbaudīti dažādi temperatūras un laika profili, grunts secība un daudzums, kā arī citu vielu koncentrācija reakcijas maisījumā. Viltus pozitīvi rezultāti parādās kā signāli, kurus nevar piešķirt vēlamajam produktam. Lielākās problēmas rada DNS piesārņošana, ko rada pētnieks vai avots, kas nav analizējamais. Baktēriju izcelsmes DNS ietekmē arī polimerāzes ķēdes reakcijas rezultātu. Valkājot cimdus un ļoti uzmanoties, šādas kļūdas var novērst un formulēt ticamus secinājumus par pastiprinātajiem produktiem.
