Patch-clamp tehnika ir nosaukums, kas piešķirts elektrofizioloģiskai mērīšanas tehnikai. Tas ļauj mērīt jonu strāvas caur atsevišķiem kanāliem plazmas membrānā.
Kāda ir plākstera skavas tehnika?
Plākstera skavas tehnika vai plākstera skavas metode pieder elektrofizioloģijai, kas ir neirofizioloģijas nozare, kas nodarbojas ar signālu elektroķīmisko pārraidi nervu sistēmas. Ar šīs metodes palīdzību ir iespējams vizualizēt atsevišķus jonu kanālus šūnu membrānu ķermeņa šūnas. Tas ietver dažu pikoamperu strāvu mērīšanu. Plākstera skavas tehniku pirmo reizi 1976. gadā aprakstīja vācu biofiziķis Ervīns Nehers un vācu ārsts Berts Sakmans. Abiem zinātniekiem 1991. gadā tika piešķirta Nobela prēmija fizioloģijā vai medicīnā par skavas-plākstera tehnikas attīstību. Tādējādi elektrofizioloģiskos pētījumus praktiski pārveidoja plākstera skavas tehnika, jo tas pavēra iespēju novērot elektrisko uzvedību pie membrānas proteīni indivīda molekulas. Termins plāksteris nāk no angļu valodas un nozīmē “plāksteris”. Tas attiecas uz nelielu membrānas daļu zem plākstera pipetes, ko izmanto kā mērīšanas elektrodu. Mērīšanas procesā membrānas plāksteris tiek fiksēts vai piestiprināts (lai piestiprinātu) pie noteiktiem potenciāliem.
Funkcija, ietekme un mērķi
Plākstera skavas tehnika ir elektrofizioloģiskās analīzes metode. Tas ir balstīts uz bioloģisko faktu, ka šūnās ir liels poru un jonu kanālu skaits. Katrā šūnā un ārpus tās rodas dažādas jonu koncentrācijas vai lādiņi, kas ir atkarīgi no šūnas fizioloģiskā stāvokļa. Membrānas lipīdu divslānis nav caurlaidīgs ūdens molekulas kā arī joni. Neskatoties uz to, lādēto daļiņu apmaiņa notiek pāri šūnu membrānu neregulāri. Iemesls tam ir jonu kanālu atkarība no sprieguma. Ja tiek sasniegts noteikts membrānas potenciāls, kanāli tiek atvērti pēc principa “viss vai nekas”. Tieši šeit tiek izmantota plākstera skavas tehnika. Tādā veidā mērīšanas pipete tiek virzīta uz jonu kanālu, neiekļūstot šūnu membrānu. Tādā veidā var precīzi noteikt vietējo elektrisko potenciālu. Noplūdes strāvas, kas varētu ietekmēt mērījuma rezultātu, parasti var novērst ar elektriski ārkārtīgi stingriem savienojumiem starp pipetes malu un šūnas membrānu. Plākstera skavas metode ir balstīta uz spriegojuma skavas tehniku. Šo metodi 1930. gados izstrādāja amerikāņu biofiziķis Kenets Stjuarts Kols (1900-1984), lai mērītu strāvu uz neskartām nervu šūnām. Sprieguma skavā divu elektrodu ievietošana šūnā notiek, lai nodrošinātu komandu vai noturēšanas spriegumu. Tajā pašā laikā citu elektrodu izmanto, lai reģistrētu strāvas, kas rodas visā membrānā. Ja neirofiziologi vēlas uzzināt par elektrisko strāvu plūsmu caur noteiktām a nervu šūna membrānu, viņi izmanto plākstera skavas tehniku. Lai to izdarītu, viņi izmanto smalku stikla pipeti, kas novietota uz šūnas ārpusi. Negatīvu spiedienu var radīt, to iesūcot ar hipodermiskas šļirces palīdzību. Šīs procedūras dēļ membrāna nedaudz izliekas attiecīgajā vietā. Negatīvais spiediens nodrošina stikla piestiprināšanu pie membrānas. Tā rezultātā pipetē esošā mazā membrānas vieta tiek elektriski izolēta no pārējās membrānas. Elektrisko strāvu mērīšanai neirofiziologi izmanto plākstera skavas pastiprinātāju. Šī ir īpaša mērīšanas ierīce. Ideālā gadījumā zinātnieks var izmantot ierīci, lai iegūtu informāciju par atsevišķu jonu kanālu elektriskajām īpašībām. Jonu kanāli regulē, piemēram, ieeju un aizplūšanu nātrijs joni, kas ir pozitīvi uzlādēti, nervu šūnās. Izmeklēšana notiek cilvēku, augu vai dzīvnieku šūnās. Plākstera skavas metodi parasti veic mērīšanas stacijā, kurā ietilpst dažādas ierīces. Uz vibrāciju slāpēta mērīšanas galda ir tā sauktais Faradeja būris, kas kalpo kā elektriskais vairogs. Turklāt, lai plākstera pipeti nostādītu vietā, ir pieejams optiskais mikroskops ar mikromanipulatoru. Turklāt pipetes turētājam ir savienojums ar priekšpastiprinātāju, bet parauga turētājs ir savienots ar vannas elektrodu. Plākstera skavas pastiprinātājs darbojas, lai pastiprinātu priekšpastiprinātāja signālu. Tiek nodrošināts arī monitors, lai novērotu DUT, kā arī plākstera pipeti. Lai iespējotu digitālo ierakstīšanu, vairumā gadījumu pie mērīšanas galda ir pieejams arī dators un vairākas datu glabāšanas ierīces.
Riski, blakusparādības un bīstamība
Ar plākstera skavas tehniku nav nekādu risku. Piemēram, cilvēku, dzīvnieku vai augu šūnas tiek pārbaudītas tikai pēc to noņemšanas. Neierobežota piekļuve ārējai šūnu membrānai pastāv reti. Šī iemesla dēļ bieži ir nepieciešams sagatavot šūnas plākstera skavas metodei. Pēc plākstera pipetes iepildīšanas to iespīlē mikromanipulatorā. Tas ir savienots ar plākstera skavas pastiprinātāju un viegli piespiests neskartai šūnai. Procesu var sekot ar monitoru vai mikroskopu. Zem pipetes atrodas membrānas gabals, ko sauc par membrānas plāksteri. Neliels negatīvs spiediens, kas rodas pipetes aizmugurē, nodrošina spēcīgu savienojumu starp pipeti un membrānu. Šī procesa rezultātā tiek izveidota elektriskā pretestība starp ārējo šķīdumu un vairāku gigaohmu pipetes iekšpusi. Zinātnieki to sauc arī par “gigaseal”, kas ļauj sasniegt šūnām pievienoto plākstera skavas konfigurāciju. Plūsmā caur jonu kanālu plūstošā strāva plūst caur pipetes saturu arī lielās gigasealās pretestības dēļ. Elektrods, kas savienots ar pastiprinātāju, tiek iegremdēts pipetes šķīdumā, ļaujot izmērīt atsevišķu jonu kanālu aktivitātes plākstera membrānā.
