Kas ir PCR tests?
PCR tests ir laboratorijas metode, ko izmanto molekulārajā bioloģijā un medicīnā. Testu izmanto tiešai ģenētiskā materiāla noteikšanai un raksturošanai. Eksperti uzskata, ka PCR metode ir viegli izpildāma, universāli piemērojama un izturīga.
Laboratorijā PCR tests sastāv no diviem posmiem. Pirmajā posmā esošais ģenētiskais materiāls tiek pastiprināts, izmantojot polimerāzes ķēdes reakciju (PCR). Tas ļauj pārbaudīt vismazākās DNS pēdas. Tas ir arī iemesls, kāpēc PCR testi reaģē tik jutīgi.
Otrajā posmā ģenētiskais materiāls tiek atdalīts atbilstoši tā īpašībām, “sašķirots” un tādējādi raksturots. Citiem vārdiem sakot, tiek noteikta smalkā DNS struktūra.
Ir daudz iespējamo pielietojumu: ārsti izmanto PCR testu, piemēram, lai pārbaudītu uztriepes uz koronavīrusu klātbūtni, asins nodošanu HIV vai jaundzimušo skrīningu uz iespējamām iedzimtām slimībām. Ar PCR palīdzību var noskaidrot arī bakteriālas infekcijas – piemēram, ar tuberkulozes patogēnu – vai parazitāras infekcijas (malāriju).
Tie palīdz arī notiesāt vainīgos tiesu medicīnā, pamatojoties uz viņu ģenētiskajiem pirkstu nospiedumiem vai tiek izmantoti kā paternitātes testi.
Cik ilgi ir derīgs PCR tests?
PCR testa rezultāts parasti ir derīgs 48 stundas no parauga ņemšanas brīža.
Cik uzticams ir PCR tests?
PCR ir pārbaudīta un pārbaudīta noteikšanas metode molekulārajā diagnostikā un medicīnā. Tas tiek uzskatīts par tā saukto zelta standartu ar ļoti zemu kļūdu līmeni. Testus īpaši raksturo ļoti augsta jutība un specifiskums.
Jutīgums ir uzticamība, ar kādu testā tiek atrasts nosakāmais ģenētiskais materiāls.
Specifiskums ir pārliecība, ar kādu tests nosaka, ka attiecīgā ģenētiskā materiāla paraugā nav.
Kad PCR testi darbojas Sars-CoV-2 infekcijas gadījumā?
Parasti PCR tests atklāj korona infekciju divas līdz trīs dienas pirms un līdz 20 dienām pēc simptomu parādīšanās. Pat inficētiem cilvēkiem, kuri paliek pilnīgi bez simptomiem, tests ir efektīvs kritiskā laika posmā, kad viņi var inficēt citus.
Atsevišķos gadījumos noteikšana ir iespējama pat 60 dienas pēc simptomu parādīšanās.
Iespējamie kļūdu avoti
Kļūdu līmenis DNS kopēšanas procesā praksē ir niecīgs. Lai gan DNS polimerāzes nekad nav bez kļūdām, tām gandrīz nav nozīmes PCR testa procedūrā.
Praksē iespējamie kļūdu avoti vairāk meklējami paraugu ņemšanā: tāpēc ir svarīgi, lai uztriepes veiktu apmācīti medicīnas speciālisti. Siekalu un skalošanas paraugi, iespējams, varētu samazināt testa precizitāti, jo šeit rodas atšķaidīšanas efekti.
Kā darbojas PCR tests?
PCR testu veic, piemēram, pie ģimenes ārsta vai īpašos testu centros. Pirmkārt, ārsti vai apmācīti medicīnas speciālisti ņem paraugu. Pārbaudei parasti tiek ņemts tampons no augšējiem elpceļiem. Tas parasti izpaužas kā mutes vai nazofaringijas tampons.
Ir iespējama arī skalošana ar skalošanas šķīdumu. Asins paraugs ir netipisks koronas noteikšanai, taču to plaši izmanto, piemēram, jaundzimušo skrīningā.
Neatkarīgi no ņemtā parauga veida ģenētiskais materiāls tiek atrasts uz vates tampona, skalošanas šķīdumā vai asins pilē. Šo parauga materiālu nosūta uz laboratoriju, kur to izolē un attīra.
Pēc tam PCR testu iedala divos posmos:
- PCR: šajā posmā tiek pastiprināts sākotnējā ģenētiskā materiāla daudzums.
1. darbība: PCR — "polimerāzes ķēdes reakcija"
“PCR” ir pirmais no diviem posmiem: šeit tiek pastiprināts pieejamās sākuma DNS daudzums. Tas ir tāpēc, ka ģenētisko materiālu var analizēt tikai tad, kad tas ir pieejams pietiekamā daudzumā. Vairumā gadījumu tā ir cilvēka DNS; koronavīrusa testu gadījumā tā ir vīrusa RNS.
Saīsinājums PCR apzīmē “polimerāzes ķēdes reakciju”.
Kas nepieciešams PCR?
Sākuma DNS ievieto reakcijas traukā ar īpašām vielām. Esošais ģenētiskais materiāls kalpo par šablonu, kas tiek kopēts noteiktu enzīmu (Taq polimerāzes) un noteiktu pamata DNS celtniecības bloku klātbūtnē.
Kopēšanas process notiek vairākos atkārtotos palaijumos (ciklos).
Konkrēti, kopā pievieno šādas vielas:
- Sākuma DNS: parauga materiāls, kas ir jākopē.
- Galvenie DNS celtniecības bloki: tie ir nukleobāzes adenīns, timīns, citozīns un guanīns.
- DNS polimerāze: ferments, kas saista atsevišķus DNS blokus, veidojot precīzi noteiktu DNS virkni. Jauniegūtais pavediens ir sākotnējā izejmateriāla spoguļattēls (komplementārs).
- Primers: tie sastāv no 16 līdz 24 bāzes pāriem un kalpo kā sākuma pozīcija un sākuma signāls. Praimeri parāda DNS polimerāzi, kurā (sākuma DNS) pozīcijā sākas kopēšanas process.
Kā tiek veikts PCR tests?
Tagad, kad reakcijas traukā ir visas PCR nepieciešamās vielas, var sākties faktiskais ģenētiskā materiāla kopēšanas process. To iedarbina, kontrolē un atkal aptur tikai temperatūra.
Tāpēc reakcijas trauks vienu pēc otra tiek uzkarsēts vai atdzesēts līdz dažādām temperatūrām. Tas tiek darīts, izmantojot īpašu ierīci, kas pazīstama kā termiskais ciklers. Visa reakcija ilgst apmēram vienu līdz divas stundas.
Atsevišķi PCR cikla posmi ir
- DNS dubulto pavedienu denaturācija: paraugu karsē līdz aptuveni 90 grādiem pēc Celsija. Tādējādi sākotnējā DNS dubultā virkne tiek sadalīta divās atsevišķās (komplementārās) atsevišķās virknēs.
- Gruntiņu piestiprināšana: temperatūra tiek pazemināta līdz nedaudz zem 60 grādiem pēc Celsija. Tas izraisa praimeru (forward primer, reverse primer) pievienošanos noteiktām pozīcijām attiecīgajās atsevišķās DNS virknēs.
Pēc cikla beigām temperatūra atkal tiek paaugstināta līdz aptuveni 90 grādiem pēc Celsija – cikls sākas no jauna.
PCR metodi var izmantot, lai pastiprinātu DNS sekvences līdz aptuveni trim kilobāzu pāriem (kbp). Tas atbilst aptuveni 3,000 pamata DNS celtniecības blokiem, kas savienoti kopā, veidojot “ķēdi”. Salīdzinājumam: cilvēka genoms šūnas darbības rasējumi un informācija glabājas aptuveni trīs miljardos bāzes pāru – koronavīrusa genoms savukārt sastāv no 30,000 XNUMX bāzes pāru. Tāpēc PCR tests var pastiprināt un pārbaudīt tikai īsas kopējās DNS daļas.
Primeriem ir izšķiroša nozīme
Primeru izvēlei ir izšķiroša nozīme PCR procedūrā. Piemēram, Sars-CoV-2 diagnostikā tiek izmantoti vairāki praimeri (multiplex PCR).
Tādējādi Corona PCR testi meklē trīs dažādus vīrusu gēnus: tas palielina kopējo specifiskumu līdz gandrīz 99.99%. Tas nozīmē, ka ar šo augsto trāpījumu līmeni uz 10,000 XNUMX testu ir tikai viens kļūdaini pozitīvs tests (ja paraugi ir ņemti pareizi).
Cik daudz kopēta ģenētiskā materiāla tagad ir pieejams?
Pieņemsim, ka pēc pirmā cikla ir divas identiskas DNS dubultšķiedras.
Pēc katra cikla (kopētā) ģenētiskā materiāla daudzums dubultojas. Tāpēc DNS daudzums pieaug eksponenciāli.
Ārsti parasti atkārto šo procesu apmēram divdesmit līdz trīsdesmit reizes.
Tēlaini izsakoties, tas nozīmē, ka pat tad, ja sākumā paraugā tiek atrasta tikai viena DNS dubultspirāle, pēc divdesmit cikliem reakcijas traukā jau ir miljons identisku kopiju.
Ko nozīmē Ct vērtība?
Veikto PCR ciklu skaits ir norādīts tā sauktās Ct vērtības veidā. “Ct” ir atvasināts no angļu valodas termina “cycle threshold”. Šī Ct vērtība ļauj sniegt apgalvojumus par meklējamā ģenētiskā materiāla daudzumu.
Ar zemu Ct vērtību 20 ir daudz sākuma ģenētiskā materiāla. Taču, ja Ct vērtība ir augsta – aptuveni 30 cikli –, DNS ir attiecīgi maz. Tāpēc PCR cikls jāveic biežāk.
2. darbība: elektroforēze “Kārtošana pēc izmēra”
Kad ir pieejams pietiekami daudz “bagātināta” ģenētiskā materiāla, var veikt elektroforēzi. Šajā procesā zinātnieki izmanto īpašu DNS īpašību: tās elektrisko lādiņu.
Atsevišķi DNS bloki ir saistīti viens ar otru, izmantojot (negatīvi) uzlādētu cukura-fosfāta mugurkaulu. Jo garāka ir noteikta DNS secība, jo augstāks ir tās elektriskais lādiņš.
Tas ļauj pārbaudīt un raksturot ģenētisko materiālu. Praksē nezināms paraugs parasti tiek attēlots pret zināmu atsauci uz “sākuma līnijas” un pēc noteikta laika tiek salīdzināts viens ar otru.
Ja “migrācijas ātrums” ir vienāds abām sekvencēm, tas nozīmē, ka noteikšana, visticamāk, ir pozitīva: noteikšana, ļoti iespējams, ir pozitīva — paraugā ir ietverts jūsu meklētais gēns.
Īpašs koronavīrusa gadījums: parauga sagatavošana un RT-PCR
Koronavīrusa atklāšana ir īpašs gadījums. Sars-CoV-2 ir viens no tā sauktajiem RNS vīrusiem. Tas nozīmē, ka Sars-CoV-2 ģenētiskais materiāls atrodas RNS (ribonukleīnskābes) formā.
RNS atšķiras no DNS tikai dažos aspektos. Cita starpā tas ir kā viena virkne, un tā pamatā ir cukura riboze, nevis 2′-dezoksiriboze. Timīna nukleobāze tiek aizstāta ar uracilu kā ceturto bāzi.
Pirms parastā PCR testa šī vīrusa RNS ir “jāpārraksta” DNS. Šo procesu sauc par reverso transkripciju (RT) — tāpēc termins RT-PCR. Šī procesa ietvaros tiek iegūta viena cDNS virkne (“komplementārā DNS”). Nākamajā solī cDNS vienu virkni papildina otra spoguļattēla DNS virkne.
Cik ilgs laiks nepieciešams, lai iegūtu rezultātu?
Kad paraugs ir nosūtīts uz laboratoriju, rezultātu parasti saņemsiet vienas vai divu darba dienu laikā. Testēšanas centros, kas bieži pārbauda paraugus tieši uz vietas, tas var aizņemt tikai dažas stundas. Laika posms lielā mērā ir atkarīgs no attiecīgā testēšanas centra un tā loģistikas.
Neskatoties uz sarežģītajiem darba procesiem, mūsdienu laboratorijas spēj veikt PCR testus ar lielu caurlaidspēju. Pārbaudes palīdz veikt īpašas automatizētas ierīces.
Tomēr PCR tests tiek uzskatīts par salīdzinoši “lēnu”, bet vēl jo vairāk uzticamu noteikšanas metodi.
Kas notiek, ja rezultāts ir pozitīvs?
Ja paraugs tiek ņemts pareizi, pozitīvs PCR tests nozīmē, ka ir ļoti liela varbūtība, ka pārbaudītā persona ir inficēta ar Sars-CoV-2.
Ja, izmantojot PCR testu, Jums ir apstiprināta inficēšanās ar koronavīrusu, sabiedrības veselības departaments saņems attiecīgās laboratorijas paziņojumu par pozitīvo testa rezultātu. Šādā gadījumā sabiedrības veselības departaments noteiks izolāciju vai karantīnu.
Vai es esmu automātiski lipīgs, ja man ir pozitīvs PCR tests?
Parasti jā. Bet ne vienmēr. PCR testa rezultāts vienmēr jāinterpretē kontekstā. Pozitīvs tests, pirmkārt un galvenokārt, nozīmē, ka jūs nēsājat vīrusu materiālu.
Dažkārt noder papildu antivielu tests
Šādos gadījumos antivielu tests nodrošina noteiktību, kas apstiprina PCR testa derīgumu. Vislabāk to apspriest ar savu ārstu. Tie var palīdzēt pareizi interpretēt PCR testa rezultātu.
Ko darīt, ja rezultāts ir negatīvs?
Negatīvs PCR testa rezultāts, visticamāk, nozīmē, ka parauga ņemšanas laikā jums nebija Covid-19 un tāpēc pašlaik neesat infekciozs. Tomēr jūs varētu būt agrīnā infekcijas fāzē.
Korona infekciju parasti var atklāt tikai otrajā vai trešajā dienā pēc inficēšanās. Tāpēc rezultāts nav brīva piespēle. Tādēļ jums ir jāturpina ievērot sociālās distancēšanās un higiēnas noteikumus un jāturpina valkāt FFP2 masku – lai aizsargātu sevi un citus.
PCR tests bērniem
PCR tests bērniem neatšķiras no PCR testa pieaugušajiem. Gan paraugu ņemšana, gan rezultātu interpretācija attiecas gan uz bērniem, gan pieaugušajiem.
Kādi ir PCR testa riski?
PCR tests nav saistīts ar fizisku risku. Tikai parauga ņemšanu ar nazofaringeālo uztriepi daži cilvēki uztver kā satraucošu vai nepatīkamu.
Cik maksā PCR tests?
Lūdzu, ņemiet vērā: ja esat pārbaudījis sevi mājās un saņēmis pozitīvu rezultātu, nekavējoties pierakstieties pie sava ģimenes ārsta pa tālruni. Jūsu ārsts pa tālruni pārrunās ar jums turpmākās darbības.
Alternatīvi, vislabāk ir zvanīt pa tālruni 116 117, lai reģistrētos PCR pārbaudei. Ideālā gadījumā jums vajadzētu palikt mājās līdz apstiprināšanas pārbaudei, lai aizsargātu sevi un citus.
